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咨詢(xún)電話(huà)：19945629638實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)反應(yīng)指的是在PCR進(jìn)行的同時(shí)，對(duì)其過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，一般簡(jiǎn)寫(xiě)為。實(shí)時(shí)定量PCR與終點(diǎn)PCR的區(qū)別在于數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行收集。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，反應(yīng)以循環(huán)中檢測(cè)到目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間點(diǎn)為特征，目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會(huì)越快觀察到熒光的顯著增加（擴(kuò)增曲線越靠近的X值越低）。相反，終點(diǎn)法檢測(cè)測(cè)量的是PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的基本原理：
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的較小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過(guò)程中熒光信號(hào)由本底開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。
方程式的斜度可以用來(lái)檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)，這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。
