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實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
技術(shù)的基本原理
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)Ct值概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過(guò)程中熒光信號(hào)由本底開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。
方程式的斜度可以用來(lái)檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)，這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的軟件特點(diǎn)：
●反應(yīng)板設(shè)置指南軟件使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常簡(jiǎn)單，包括復(fù)雜的多色熒光實(shí)驗(yàn)；
●可選擇快速、標(biāo)準(zhǔn)或者9600反應(yīng)模式；
●實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線；
●實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以增加PCR循環(huán)數(shù)；
●自動(dòng)設(shè)置熒光基線，自動(dòng)計(jì)算熒光閾值使數(shù)據(jù)分析大大簡(jiǎn)化；
●可在同一反應(yīng)板采用多種標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)靶基因進(jìn)行定量，可以簡(jiǎn)化工作流程以及下游產(chǎn)物分析；
●基因表達(dá)相對(duì)定量軟件提供強(qiáng)大的結(jié)果分析顯示，可以自動(dòng)將多達(dá)10塊96孔板基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)分析，并自動(dòng)去除無(wú)關(guān)項(xiàng)數(shù)據(jù)；
●自動(dòng)SNP分析軟件可以簡(jiǎn)單直觀的圖表輸出分型結(jié)果并自動(dòng)進(jìn)行分型質(zhì)量評(píng)分；
●解離曲線數(shù)據(jù)采集操作簡(jiǎn)單，觀察方便，可以在儀器運(yùn)行時(shí)觀察解離曲線數(shù)據(jù)；
●觀察實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線時(shí)可以非常方便的標(biāo)定所對(duì)應(yīng)的樣品孔位置；
●光源使用時(shí)間監(jiān)測(cè)及儀器系統(tǒng)自我診斷程序。
